جلد 48، شماره 3 - ( 9-1403 )
جلد 48 شماره 3 صفحات 20-9 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Ethics code: IR.SBMU.MSP.REC.1401.483
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Bahari M, Kargar Kheirabad A, Yeganeh F. Construction of a Chemically- Conjugated DNA Aptamer- Protein Hybrid Molecule to Develop the Enzyme- Linked Apta- Sorbent Assay. Research in Medicine 2024; 48 (3) :9-20
URL: http://pejouhesh.sbmu.ac.ir/article-1-3389-fa.html
URL: http://pejouhesh.sbmu.ac.ir/article-1-3389-fa.html
بهاری مهشید، کارگر خیرآباد علی، یگانه فرشید. ساخت مولکول هیبریدی پروتئین- آپتامر با استفاده از کونژوگاسیون مستقیم برای استفاده در روش الازای مبتنی بر آپتامر. پژوهش در پزشکی. 1403; 48 (3) :9-20
گروه ایمونولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران. ، fyeganeh@sbmu.ac.ir
چکیده: (511 مشاهده)
سابقه و هدف: آپتامرها مولکول‌های (DNA) Deoxyribonucleic acid یا(RNA) Ribonucleic acid تک‌رشته‌ای هستند که به دلیل دارا بودن میل پیوندی و اختصاصیت بالا برای مولکول‌های هدف و برتری‌هایی نسبت به آنتی‌بادی‌ها مورد توجه قرار گرفته‌اند و به‌عنوان جایگزین‌هایی برای آنتی‌بادی‌ها در روش‌های تشخیصی مختلف از جمله الازا مطرح شده‌اند. هدف از مطالعه حاضر، ارائه روشی برای کونژوگاسیون شیمیایی آپتامر به آنزیمhorseradish peroxidase (HRP) با استفاده از لینکر sulfo -succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1- carboxylate (sulfo- SMCC) بود که توسعه آپتامرها در روش‌های تشخیصی را تسهیل کند. استفاده از این روش برای کونژوگاسیون آپتامر برای نخستین بار انجام شده است.
روش کار: مطالعه حاظر در دو قسمت انجام شده است: 1- طراحی و ساخت به روش اکتشافی و 2- بررسی تجربی آن. ابتدا، آنزیم HRP به لینکر sulfo- SMCC متصل و سپس با ستون کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون خالص‌سازی شد. در ادامه HRP فعال شده با آپتامر تیوله، مجاور و کونژوگاسیون از طریق واکنش شیمیایی مالئیمید- تیول انجام و کونژوگه آپتامر HRP- با استفاده از فیلتر آمیکون تخلیص شد. برای تأیید کونژوگاسیون آپتامر به HRP، عملکرد کونژوگه حاصل با استفاده از تست الازا مستقیم سنجیده شد و بررسی‌های آماری از طریق نرم‌افزار 10Graphpad prism و تست آماری ANOVA انجام شد.
یافته‌ها: این تحقیق نشان داد که ساخت مولکول هیبریدی پروتئین- آپتامر با استفاده از کونژوگاسیون مقدوراست. ساخت مولکول هیبریدی پروتئین در فرایند کونژوگاسیون، آنزیم HRP از طریق گروه آمینی خود به انتهای NHS- ester لینکر sulfo- SMCC متصل و پیوندهای آمیدی پایدار تشکیل شد. آپتامر تیوله با پیوند تیواتری به لینکر متصل شد. در فرآیند ارزیابی کونژوگاسیون از تست الازای مستقیم با غلظت‌های مختلف (۱، ۲ و ۵ میکرومولار) آپتامر کونژوگه استفاده شد و در هر غلظت، نمونه‌ها به صورت دوپلیکیت آزمایش شد. داده‌ها نشان دادند که غلظت‌های مختلف آپتامر کونژوگه تأثیر معناداری روی عملکرد آپتامر داشته‌اند. میانگین جذب نوری در غلظت‌های مختلف ۱، ۲ و ۵ میکرومولار در نمونه‌های مثبت به ترتیب 0/5 ، ۱ و 1/6 بود، در حالی که در نمونه‌های منفی میانگین جذب نوری 0/04 بود که نشان‌دهنده تفاوت معنادار آماری (0/05 > P) بین گروه‌ها و کونژوگاسیون موفق آپتامر بدون تأثیر بر عملکرد آن است.
نتیجه‌گیری: به نظر می‌رسد که اولا ساخت مولکول هیبریدی پروتئین مقدور است، ثانیاً استفاده از آن احتمالاً مفید خواهد بود و به نظر می‌رسد که کونژوگاسیون آپتامر به HRP از طریق لینکر sulfo- SMCC بدون تأثیر منفی بر عملکرد آپتامر امکان‌پذیر است.
روش کار: مطالعه حاظر در دو قسمت انجام شده است: 1- طراحی و ساخت به روش اکتشافی و 2- بررسی تجربی آن. ابتدا، آنزیم HRP به لینکر sulfo- SMCC متصل و سپس با ستون کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون خالص‌سازی شد. در ادامه HRP فعال شده با آپتامر تیوله، مجاور و کونژوگاسیون از طریق واکنش شیمیایی مالئیمید- تیول انجام و کونژوگه آپتامر HRP- با استفاده از فیلتر آمیکون تخلیص شد. برای تأیید کونژوگاسیون آپتامر به HRP، عملکرد کونژوگه حاصل با استفاده از تست الازا مستقیم سنجیده شد و بررسی‌های آماری از طریق نرم‌افزار 10Graphpad prism و تست آماری ANOVA انجام شد.
یافته‌ها: این تحقیق نشان داد که ساخت مولکول هیبریدی پروتئین- آپتامر با استفاده از کونژوگاسیون مقدوراست. ساخت مولکول هیبریدی پروتئین در فرایند کونژوگاسیون، آنزیم HRP از طریق گروه آمینی خود به انتهای NHS- ester لینکر sulfo- SMCC متصل و پیوندهای آمیدی پایدار تشکیل شد. آپتامر تیوله با پیوند تیواتری به لینکر متصل شد. در فرآیند ارزیابی کونژوگاسیون از تست الازای مستقیم با غلظت‌های مختلف (۱، ۲ و ۵ میکرومولار) آپتامر کونژوگه استفاده شد و در هر غلظت، نمونه‌ها به صورت دوپلیکیت آزمایش شد. داده‌ها نشان دادند که غلظت‌های مختلف آپتامر کونژوگه تأثیر معناداری روی عملکرد آپتامر داشته‌اند. میانگین جذب نوری در غلظت‌های مختلف ۱، ۲ و ۵ میکرومولار در نمونه‌های مثبت به ترتیب 0/5 ، ۱ و 1/6 بود، در حالی که در نمونه‌های منفی میانگین جذب نوری 0/04 بود که نشان‌دهنده تفاوت معنادار آماری (0/05 > P) بین گروه‌ها و کونژوگاسیون موفق آپتامر بدون تأثیر بر عملکرد آن است.
نتیجه‌گیری: به نظر می‌رسد که اولا ساخت مولکول هیبریدی پروتئین مقدور است، ثانیاً استفاده از آن احتمالاً مفید خواهد بود و به نظر می‌رسد که کونژوگاسیون آپتامر به HRP از طریق لینکر sulfo- SMCC بدون تأثیر منفی بر عملکرد آپتامر امکان‌پذیر است.
واژه‌های کلیدی: آپتامر، کونژوگاسیون، لینکر، سنجش ایمنی مرتبط با آنزیم (الایزا)، سنجش ایمنی مبتنی بر آپتامر مرتبط با آنزیم (الازا)
نوع مطالعه: پژوهشی |
موضوع مقاله:
ایمنی‌شناسی
دریافت: 1403/3/29 | پذیرش: 1403/8/16 | انتشار: 1403/11/1
دریافت: 1403/3/29 | پذیرش: 1403/8/16 | انتشار: 1403/11/1
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
This Journal is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License | Research in Medicine
Designed & Developed by : Yektaweb