fa افزایش میزان بیان پروتئین متصل شونده به دافی در پلاسمودیوم ویواکس به عنوان پروتئین کاندید واکسن مرحله خونی مالاریا انگل شناسی Parasitology پژوهشی Original چکیده سابقه و هدف: منطقه II غنی از سیستئین پروتئین متصل شونده به دافی در پلاسمودیوم ویواکس (PvDBP-II) نقشی اساسی در حمله مروزوئیت‌های انگل به اریتروسیت‌های انسان ایفا می‌نماید. به همین دلیل این پروتئین به عنوان پروتئین کاندید واکسن در بررسی پاسخ‌های ایمونولوژیکی مورد نظر محققین است. هدف از این مطالعه بیان پروتئین مذکور به میزان بالا با استفاده از سیستم بیانی پروکاریوتی است. روش بررسی: پس از کلونینگ PvDBP-II در وکتور pGEM T easy، ساب کلونینگ در وکتورهای بیانی pET28a، pET24d و pQE30 انجام و بیان پروتئین در سویه‌های BL21(DE3) و M15(pREP4) اشرشیا کلی که محتوی ساختارهای بیانی ذکر شده بودند، تحت شرایط متفاوت ازجمله محیط کشت، دمای انکوباسیون و زمان‌های مختلف، بیان پس از القاء مورد بررسی قرار گرفت. خالص سازی به کمک روش متال افینیتی کروماتوگرافی تحت شرایط احیاء صورت گرفت و محصول توسط روش‌های SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ مورد تائید قرار گرفت. در نهایت غلظت پروتئین خالص شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 280 نانومتر اندازه گیری شد. یافته‌ها: بیان rPvDBP-II 4 ساعت پس از القاء با IPTG 1میلی مولار در دمای 37 درجه سانتی گراد در محیط LB2x و با استفاده از سیستم بیانی M15-pQE30 به میزان قابل قبولی صورت گرفت ولی در دو سیستم بیانی BL21-pET28a و BL21-pET24d، بیان پروتئین مورد نظر به مقدار بسیار کم 200 مشاهده گردید. سایز پروتئین نوترکیب حاصل بر روی ژل طبق انتظار 47 کیلودالتون (اسید آمینه 588-198) بود. وسترن بلاتینگ با استفاده از آنتی بادی های anti-His و سرم افراد مبتلا به عفونت پلاسمودیوم ویواکس موید بیان PvDBP-II بود و غلظت پروتئین حاصل 1200 میکروگرم در میلی‌لیتر ارزیابی شد. نتیجه‌گیری: در این مطالعه با استفاده از سیستم بیانی پروکاریوتی E. coli (M15/BL21) و با انجام حداقل مراحل ترانسفورمیشن موفق به افزایش چشمگیر میزان بیان و دسترسی به فرم خالص و نوترکیب PvDB-II بدون نیاز به انجام آزمایشات پیچیده و گران قیمت شدیم که این امر می‌تواند در طراحی واکسن منطقه‌ای علیه مالاریای ویواکس بسیار مفید و کارآمد باشد. واژگان کلیدی: پلاسمودیوم ویواکس، پروتئین متصل شونده به دافی، بیان، سیستم بیانی pQE30، E. coli. Abstract Background: The cysteine rich region II of Plasmodium vivax Duffy Binding Protein (PvDBP-II) is essential during merozoite invasion into the human erythrocyte and because of this biological importance, PvDBP-II is a vaccine candidate and a target for protective immunity against vivax malaria. In the present study we improved the yield of this protein by using E. coli (M15/BL21) expression system, which is easier for handling than genetic engineering approaches. Methods: After cloning of PvDBP-II in pGEM T easy vector, sub-cloning was carried out in pET 28a, pQE30 and pET24d expression vectors. Then expression was performed on the 1mM IPTG-induced M15 (pREP) and BL21(DE3) strains of E. coli containing expression constructs in different expression conditions such as different culture medias and temperatures. Purification was performed by metal affinity chromatography using Ni-NTA agarose under denaturing conditions. Elutes were separated on SDS-PAGE and western blotting was carried out to detect rPvDBP-II. Yields of purified rPvDBP-II were estimated by measuring optical density at 280 nm. Results: Expression of rPvDBP-II was successfully performed using M15-pQE30 expression system at OD600 = 0/6, 1mM IPTG, in LB2 and 37oC. Size of the recombinant protein on SDS-PAGE was 47 KD (a.a 198-588) and the highest amount of expression was 4h after induction. Western blotting with anti-His antibodies and human P. vivax infected serum, confirmed expression of PvDBP-II. Expression of PvDBP using M15-pQE30 yielded about 1200 μg/ml. Conclusion: In the present investigation, production of expressed PvDBP-II in E. coli (M15/BL21) expression system, in comparison with other two expression system, was in sufficient amounts for further evaluation without using complicated and expensive methods, with least process of transformation. Such a recombinant protein is highly needed for development of a recombinant vaccine and sero-epidemiological study of P. vivax malaria. Keywords: Type Plasmodium vivax, Duffy Binding Protein, Expression, pQE30-E.coli Expression system. واژگان کلیدی: پلاسمودیوم ویواکس، پروتئین متصل شونده به دافی، بیان، سیستم بیانی pQE30، E. coli. Keywords: Type Plasmodium vivax, Duffy Binding Protein, Expression, pQE30-E.coli Expression system. 35 42 http://pejouhesh.sbmu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-593&slc_lang=fa&sid=1 Laleh Babaeekhou لاله بابائی خو 10031947532846006175 10031947532846006175 No Islamic Azad University, Islamshahr branch, Tehran, Iran دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اسلامشهر Sedigheh Zaker صدیقه ذاکری zakeris@pasteur.ac.ir 10031947532846006176 10031947532846006176 Yes Malaria and Vector Research Group (MVRG), Biotechnology Research Center (BRC), Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran گروه تحقیقات مالاریا و ناقلین، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، انستیتو پاستور ایران Akram Abouie Mehrizi اکرم ابوئی مهریزی 10031947532846006177 10031947532846006177 No Malaria and Vector Research Group (MVRG), Biotechnology Research Center (BRC), Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran گروه تحقیقات مالاریا و ناقلین، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، انستیتو پاستور ایران Navid Dinparast Djadid نوید دین پرست جدید 10031947532846006178 10031947532846006178 No Malaria and Vector Research Group (MVRG), Biotechnology Research Center (BRC), Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran گروه تحقیقات مالاریا و ناقلین، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، انستیتو پاستور ایران