fa کلونینگ و بهینه سازی کدون ژن فنیل آلانین دهیدروژناز در سیستم بیانی E.coli و مقایسه بیان ژن با دو پروموتور T7 و λPR پژوهشی Original <strong>سابقه و هدف: </strong>یکی از کاربردهای پزشکی آنزیم فنیل آلانین دهیدروژناز، تعیین مقدار دقیق سطح L- فنیل آلانین در سرم خون افراد جهت شناسایی بیماران مبتلا به بیماری فنیل کتونوریا می‌باشد. در این مطالعه، میزان بیان پروتئین مورد نظر بعد از بهینه سازی کدون ژنی (pdh ) در دو ناقل بیانی pET-23a و pPR37 در میزبان بیانی E.coli بررسی شد.<strong><br> روش بررسی: </strong>در این تحقیق تجربی، از ژن فنیل آلانین دهیدروژناز (pdh) بهینه سازی شده مربوط به باکتری B. Sphaericus استفاده شد که در دو ناقل بیانی pET-23a و pPR37 کلون گردید. بیان ژن pdh در ناقلین بیانی pET-23a و pPR37 به ترتیب با افزودن القاگر شیمیایی IPTG(1mM) و تغییر دمایی 30 به 42 درجه سانتی‌گراد صورت گرفت. بهینه سازی کدون با نرم افزار Jcat انجام گرفت . آنزیم فنیل آلانین دهیدروژناز(PheDH) با استفاده از ستون کروماتوگرافیNi-NTA تخلیص گردید. در ادامه با SDS-PSGE 10% وزن مولکولی نسبی زیر واحد PheDH را در حدود KDa 41 نشان داده شد. همچنین خلوص و میزان پروتئین توسطSDS-PAGE تعیین گردید.<strong><br> یافته‌ها: </strong>بیشترین میزان بیان 8 ساعت بعد از القاء در سازه pETpdh/ BL21(DE3)plysS مشاهده شد، در حالی که میزان بیان در همان مدت زمان در سازه دیگر بسیار پایین بود. فعالیت ویژه آنزیم بعد از به کار گیری روش تخلیصی U/mg 705 از پروتئین محاسبه شد. بیان پروتئین مورد نظر بعد از بهینه سازی کدون و در سازه ژنی pETpdh بیشتر بود.<br> <strong>نتیجه‌گیری:</strong> با توجه به مقایسه دو سازه ژنی در بیان پروتئین مورد نظر، سازهpETpdh احتمالاًجهت تولید آنزیم PeDH در مقیاس بالا مناسب‌تر بوده و بر اساس این تحقیق برای این کار توصیه می‌گردد.&nbsp; <strong>Background</strong>: This study was performed on the base of importance of phenylalanine dehydrogenase (PheDH) in the outbreak of phenylketonuria (PKU). In order for PKU screening one of the medical applications of enzyme is, identifying and quantifying the exact amount of L-phe in blood serum. The research question was whether the level of protein expression changes after optimization of codon usage in pET-23a and pPR37 expression vectors in E.coli expression system host and the level of expression of the two vectors are different. In this study, experimental approach has been performed.<br> <strong>Materials and methods: </strong>In this study, pdh gene optimized was used belonging to B. sphaericus that was cloned in the two expression vectors. Codon optimization was performed by online Jcat software. PheDH was purified by Ni-NTA chromatography column. The relative molecular mass of PheDH subunit was about 41KDa by SDS-PAGE 10%.The purity and amount of proteins were assessed by SDS-PAGE.<br> <strong>Results</strong>: The highest rate of expression was observed at 8h after induction in pETpdh/BL21 (DE3) plysS construction. The level of expression of other construction was very low. Applying this method for purification the specific activity of enzyme was 705 U/mg of protein. Our polyhistidine-tag enzyme can be ideally used for the immobilization on a nickel coated microliter plate surface.<br> <strong>Conclusion</strong>: On the based of this research, it is recommended for large scale enzyme production. According to the comparison between the two gene construction, presumably pETpdh construction is appropriate for production of PeDH enzyme in large-scale.&nbsp; فنیل آلانین دهیدروژناز, بیان, پلاسمید, پروموتور. L-phenylalanine dehydrogenase, Expression, Plasmid, Promoter 211 219 http://pejouhesh.sbmu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-688&slc_lang=fa&sid=1 Saeed Heidari-Keshel سعید حیدری کشل 100319475328460031212 100319475328460031212 No Student Research Committee, Proteomics Research Center, Faculty of Paramedical Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran,Department of Tissue Engineering, Faculty of Advanced Medical Technologies, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran مرکز تحقیقات پروتئومیکس، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی , واحد فراهم آوری سلول های بنیادی، مرکز تحقیقات چشم، بیمارستان فارابی، دانشگاه علوم پزشکی تهران Sanam Zandian صنم زندیان 100319475328460031213 100319475328460031213 No Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی شیراز Fariba Ghasemvand فریبا قاسم وند 100319475328460031214 100319475328460031214 No Enzyme Technology Laboratory, Biochemistry Department, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran آزمایشگاه تکنولوژی آنزیم، گروه بیوشیمی، انستیتو پاستور ایران Saeid Rahman zadeh سعید رحمان زاده 100319475328460031215 100319475328460031215 No Enzyme Technology Laboratory, Biochemistry Department, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran آزمایشگاه تکنولوژی آنزیم، گروه بیوشیمی، انستیتو پاستور ایران Masoumeh imanzad معصومه ایمان‌زاد 100319475328460031216 100319475328460031216 No Faculty of Medicine, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز Navid Nezafat نوید نظافت navidnezafat@yahoo.com 100319475328460031217 100319475328460031217 Yes Enzyme Technology Laboratory, Biochemistry Department, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran آزمایشگاه تکنولوژی آنزیم، گروه بیوشیمی، انستیتو پاستور ایران