fa افزایش بیان اختصاصی ژن Cdk9 بوسیله microRNA-1 بالغ تک رشته در سلول های فیبروبلاست پژوهشی Original <p>سابقه وهدف: microRNA ها، RNA کوچک (bp22)غیر کد شونده هستند که قادرند بیان ژنها را از مسیرهای جلوگیری از ترجمه، رونویسی و تخریب RNA مهار کنند. با وجود نقش تنظیمی miR ها در شرایط فیزیولوژیک، تغییر بیان microRNA ها در شرایط بیماری مانند سرطان مشاهده می شود. بنابرین به منظور تنظیم میزان بیان &nbsp;miRها در شرایط بیماری و یا جهت مطالعه نقش تنظیمی آنها، بیان microRNA ها را با استفاده از وکتور های بیان کننده و یا از طریق سنتز miR بالغ دو رشته ای افزایش می دهند.&nbsp;<br> مواد و روش ها:<br> در این مطالعه تجربی تاثیر تنظیمی miR-1 تک رشته ای و دو رشته ای بر بیان ژن Cdk9 بررسی شد. سلول های فیبروبلاست موشی در محیط DMEM حاوی 10 درصد سرم، 100 U/ml پنی سیلین، و 0.1 mg/ml استرپتومایسین کشت داده شدند. به منظور افزایش بیان miR-1 در سلول های فیبروبلاست، پلاسمید بیان کننده miR-1 (pPRO-miR-1)، miR-1 سنتزی دو رشته ای و تک رشته ای (3 گروه ) با استفاده از لیپوفکتامین 2000 (Invitrogen, 11668-027) و طبق پروتکل های موجود به سلول ها ترانسفکت شده &nbsp;و RNA سلول ها بعد از 48 ساعت بوسیله محلول کیازول (Qiagen, Germany) استخراج گردید. &nbsp;cDNA سازی از2 &micro;g &nbsp;RNA در حضور آنزیم MLV ریورس ترنسکریپتاز و پرایمرهای Random hexamer &nbsp;و پرایمر اختصاصی microRNA-1 (شرکت زیست رویش) انجام شد. جهت انجام q-PCR از کیت SYBR Green I Master Mix استفاده شد. جهت بررسی اختلاف بین گروه ها از آزمون واریانس ANOVA استفاده شد و سطح اختلاف معناداری بین گروه ها (p value) کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.&nbsp;</p> <p>یافته ها:&nbsp;<br> پس از ترنسفکت سلول ها با پلاسمید بیان کننده miR-1 (pPRO-miR-1)، کاهش 2 برابر بیان ژن Cdk9 در سلول های ترنسفکت شده نسبت به گروه کنترل با انجام آزمایش Real time PCR نشان داده شد (p <0.01 ). &nbsp; نتایج مشابهی بعد از ترنسفکت سلول ها با miR-1 بالغ دو رشته ای (22 نوکلئوتید) مشاهده شد. در ادامه با هدف مقایسه نقش تنظیمی miR-1 &nbsp;بالغ دورشته با تک رشته، سلول ها با miR-1 بالغ تک رشته (22 نوکلئوتید) ترنسفکت شدند. نتایج حاصل از آزمایش q-PCR و وسترن بلات نشان داد که miR-1 بالغ تک رشته برخلاف miR-1 دورشته و یا پلاسمید بیان کننده miR، حدود 2 برابر میزان بیان Cdk9 افزایش می دهند (p <0.001).&nbsp;<br> نتیجه گیری<br> بر خلاف پلاسمید بیان کننده microRNA و miR بالغ دو رشته ای که باعث کاهش بیان ژن هدف می شوند، احتمال دارد microRNA تک رشته نقش فعال کننده بیان ژن هدف را داشته باشد.&nbsp;</p> <p>Abstract<br> Background: MicroRNAs (miRNAs) are endogenous, non-coding short RNAs (~22 nt) that can downregulate gene expression by translational repression, mRNA degradation, or transcriptional repression. miRNA misregulation has been implicated in pathogenic alterations such as cancer. In order to investigate microRNA functions in gene regulation and/or to modulate their expression in pathogenic conditions, microRNAs are overexpressed by using plasmid or synthetic RNA duplexes designed to mimic the miRNA of interest.&nbsp;<br> Methods: Mouse fibroblast cells were cultured in DMEM containing 10% FBS, 100 U/ml penicillin, and 0.1 mg/ml streptomycin. Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen, 11668-027) was used for transfection according to the manufacturer&rsquo;s instructions. RNA was extracted from cells and tissues using Qiazol (Qiagen, Germany), according to the manufacturer&rsquo;s protocol. 2 &micro;g RNA samples were reverse transcribed to cDNA using microRNA-1 specific stem loop and random hexamer primers and MLV reverse transcriptase.q-PCR was performed with the &lsquo;SYBR Green I Master Mix&rsquo; kit.&nbsp;<br> Results: miR-1-expressing plasmid (pPRO-miR-1) was transfected into fibroblast cells. Quantitative real time PCR determination showed that Cdk9 expression was inhibited in transfected cells compared to control. Similarly, downregulation of Cdk9 was also observed following transfection of 22 nucleotide mature double stranded miR-1. Interestingly, transfection of synthetic 22 nucleotide mature single stranded miR-1 (miR-1-3p) induced Cdk9 expression in the fibroblast cells.&nbsp;<br> Conclusion: Unlike miR-expressing vector or synthetic RNA duplexes designed to mimic the miRNA of interest that can downregulate gene expression, synthetic 22 nucleotide mature single stranded microRNA probably induces gene expression in a locus-specific manner.&nbsp;<br> &nbsp;</p> <p></p> microRNA-1, ژن Cdk9, افزایش بیان اختصاصی microRNA-1, Cdk9, locus-specific induction 153 159 http://pejouhesh.sbmu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-724&slc_lang=fa&sid=1 Zohre Bolandi زهره بلندی ghganbarian@sbmu.ac.ir 100319475328460029301 100319475328460029301 No Shahid Beheshti University of Medical Sciences دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی Hosein Ghanbarian حسین قنبریان ghganbarian@sbmu.ac.ir 100319475328460029302 100319475328460029302 Yes Shahid Beheshti University of Medical Sciences دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی