fa استرپتوکیناز: استخراج،کلون‌سازی و بیان بالای پروتئین نوترکیب فعال بین رشته ای ( مدیریت آموزشی، تحقیقات آموزشی، آموزش پزشکی ) Interdisciplinary (Educational Management, Educational research, Statistics, Medical education پژوهشی Original چکیده سابقه و هدف: استرپتوکیناز به عنوان شناخته‌شده‌ترین داروی فیبرینولیتیک، مدت مدیدی است در درمان سکته قلبی استفاده می‌شود. ویژگیهای ساختاری ساده این پروتئین زمینه لازم برای دستیابی به انواع نوترکیب آن را فراهم ساخته است. هدف از این تحقیق تهیه سوش استرپتوکوک equisimilis H46A (پربازده از نظر تولید استرپتوکیناز) برای اولین بار در ایران بود تا پس از استخراجDNA ، ژن استرپتوکیناز بگونه‌ای تکثیر شود که امکان کلون‌سازی آن در حاملهای متعدد بوجود آید. روش بررسی: پس از استخراجDNA ژنومی ژن استرپتوکیناز از دو ناحیه با استفاده از دو پرایمر بالادست و یک پرایمر پایین‌دست ضمن در نظر گرفتن یک جایگاه آنزیم برش‌دهنده معمول برای دو سر محصولات (کل ORF، bp 1323 و قسمت مربوط به پروتئین بالغ، bp 1245) تکثیر شد و در حامل pGEX-4T-2 تحت پروموتور قوی t‏ac و قابلیت بیان بالا کلون شد. پلاسمید نوترکیب حاصل بوسیله عملیات هضم دو طرفه و تعیین توالی، تأیید و در اشریشیاکلی سویهBL21(DE3 )plysS´ ترانسفورم شد. میزان بیان و فعالیت استرپتوکیناز نوترکیب مربوط به کلون واجد قطعه bp1245 با استفاده از دانسیتومتر لیزری و تست اختصاصی با سوبسترایS2251 در مقایسه با یک نمونه استرپتوکیناز خارجی مورد ارزیابی قرار گرفت. یافته‌ها: استفاده از یک آنزیم برش‌دهنده برای دو سر قطعه ژن، کلون‌شدن آن‌را در تعداد زیادی از حاملهای بیانی امکان‌پذیر ساخت. میزان بیان پروتئین نوترکیب به بیش از 45% کل پروتئینهای میزبان، موفقیت در کلون‌سازی را تأیید کرد. وجود دم اتصالی گلوتاتیون S ترانسفراز(GST) مانع فعالیت استرپتوکیناز نشد و مقدار آن بدون بهینه‌سازی و تخلیص شرایط کشت بیش از u/ml15000از کشت ثبت شد. نتیجه‌گیری: استفاده از حاملpGEX-4T-2 ضمن تولید استرپتوکیناز نوترکیب فعال و با بازدهی فراوان، دم GST را نیز به ابتدای آمینی آن اضافه می‌کند که می‌توان از آن برای تخلیص یک مرحله‌ای و آسان با استفاده از لیگاند گلوتاتیون سود برد. Abstract: Background: Streptokinase has been widely prescribed as a fibrinolytic agent for myocardial infarction. Simple structural characteristics of this protein have provided techniques for production of different recombinant types of this protein. The present study was designed to prepare equisimilisH46A subtype of streptokinase in our country. Materials and methods: Having extracted the DNA, the streptokinase gene was replicated and cloned in pGEX-4T-2. The recombinant product was transformed in BL21(DE3)plysS'. Then the recombinant streptokinase expression and performance was assessed by lasic densitometry and special test for S2251 substrate. Results: Use of a restriction enzyme for both sides of a gene may facilitate its cloning in different expressive carriers. Expression rate of recombinant protein (45%) confirmed successful cloning. Conclusions: Use of pGEX-4T-2 carrier was not only associated with active recombinant streptokinase production, added GST to its amine ending that could facilitate purification process. :pGEX-4T-2، استرپتوکیناز،کلون‌سازی، پروتئین نوترکیب، تخلیص. pGEX-4T-2, Streptokinase, Cloning, Recombinant protein, Purification 245 252 http://pejouhesh.sbmu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-305&slc_lang=fa&sid=1 MR1 Nejad Moghaddam محمدرضا نژاد مقدم 10031947532846001702 10031947532846001702 No MH2 Modarresi سیدمحمدحسین مدرسی 10031947532846001703 10031947532846001703 No M3 BabaShamsi محمد باباشمسی babashams@avesina.ac.ir 10031947532846001704 10031947532846001704 Yes M3 Chamankhah محمود چمن‌خواه 10031947532846001705 10031947532846001705 No