Pejouhesh dar Pezeshki (Research in Medicine)

fa ساخت مولکول هیبریدی پروتئین- آپتامر با استفاده از کونژوگاسیون مستقیم برای استفاده در روش الازای مبتنی بر آپتامر Construction of a Chemically- Conjugated DNA Aptamer- Protein Hybrid Molecule to Develop the Enzyme- Linked Apta- Sorbent Assay ایمنی‌شناسی Immunology پژوهشی Original <div style="text-align: justify;">سابقه و هدف: آپتامرها مولکول‌های (DNA) Deoxyribonucleic acid یا(RNA) Ribonucleic acid  تک‌رشته‌ای هستند که به دلیل دارا بودن میل پیوندی و اختصاصیت بالا برای مولکول‌های هدف و برتری‌هایی نسبت به آنتی‌بادی‌ها مورد توجه قرار گرفته‌اند و به‌عنوان جایگزین‌هایی برای آنتی‌بادی‌ها در روش‌های تشخیصی مختلف از جمله الازا مطرح شده‌اند. هدف از مطالعه حاضر، ارائه روشی برای کونژوگاسیون شیمیایی آپتامر به آنزیمhorseradish peroxidase (HRP) با استفاده از لینکر sulfo -succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1- carboxylate (sulfo- SMCC) بود که توسعه آپتامرها در روش‌های تشخیصی را تسهیل کند. استفاده از این روش برای کونژوگاسیون آپتامر برای نخستین بار انجام شده است. روش کار: مطالعه حاظر در دو قسمت انجام شده است: 1- طراحی و ساخت به روش اکتشافی و 2- بررسی تجربی آن. ابتدا، آنزیم HRP به لینکر sulfo- SMCC متصل و سپس با ستون کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون خالص‌سازی شد. در ادامه HRP فعال شده با آپتامر تیوله، مجاور و کونژوگاسیون از طریق واکنش شیمیایی مالئیمید- تیول انجام و کونژوگه آپتامر HRP- با استفاده از فیلتر آمیکون تخلیص شد. برای تأیید کونژوگاسیون آپتامر به HRP، عملکرد کونژوگه حاصل با استفاده از تست الازا مستقیم سنجیده شد و بررسی‌های آماری از طریق نرم‌افزار 10Graphpad prism   و تست آماری ANOVA  انجام شد. یافته‌ها: این تحقیق نشان داد که ساخت مولکول هیبریدی پروتئین- آپتامر با استفاده از کونژوگاسیون مقدوراست. ساخت مولکول هیبریدی پروتئین در فرایند کونژوگاسیون، آنزیم HRP از طریق گروه آمینی خود به انتهای NHS- ester لینکر sulfo- SMCC متصل و پیوندهای آمیدی پایدار تشکیل شد. آپتامر تیوله با پیوند تیواتری به لینکر متصل شد. در فرآیند ارزیابی کونژوگاسیون از تست الازای مستقیم با غلظت‌های مختلف (۱، ۲ و ۵ میکرومولار) آپتامر کونژوگه استفاده شد و در هر غلظت، نمونه‌ها به صورت دوپلیکیت آزمایش شد. داده‌ها نشان دادند که غلظت‌های مختلف آپتامر کونژوگه تأثیر معناداری روی عملکرد آپتامر داشته‌اند. میانگین جذب نوری در غلظت‌های مختلف ۱، ۲ و ۵ میکرومولار در نمونه‌های مثبت به ترتیب 0/5 ، ۱ و 1/6 بود، در حالی که در نمونه‌های منفی میانگین جذب نوری 0/04 بود که نشان‌دهنده تفاوت معنادار آماری (0/05 > P) بین گروه‌ها و کونژوگاسیون موفق آپتامر بدون تأثیر بر عملکرد آن است. نتیجه‌گیری: به نظر می‌رسد  که اولا ساخت مولکول هیبریدی پروتئین مقدور است، ثانیاً استفاده از آن احتمالاً مفید خواهد بود و به ‌نظر می‌رسد که کونژوگاسیون آپتامر به HRP از طریق لینکر sulfo- SMCC بدون تأثیر منفی بر عملکرد آپتامر امکان‌پذیر است.</div> <div style="text-align: justify;">Background and Aim: Aptamers are single-stranded nucleic acid molecules, either DNA or RNA, selected for their high affinity and specificity to target molecules and advantages over antibodies. The current study aimed to establish a robust protocol for the chemical conjugation of an aptamer to horseradish peroxidase (HRP) enzyme using the heterobifunctional crosslinker sulfo- succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo- SMCC) to facilitate the development of aptamers in diagnostic methods. This method was used for aptamer conjugation for the first time. Methods: The current study was performed in two steps: 1- Design and construction through an exploratory method and 2- Experimental investigation. This experimental study involved the activation of HRP with the sulfo- SMCC crosslinker. Post-activation, HRP was purified by size exclusion chromatography. The activated HRP was subsequently crosslinked with a thiolated aptamer via maleimide- thiol chemistry. The resulting HRP- aptamer conjugate was further purified using Amicon filters. A direct enzyme- linked aptasorbent assay (ELASA) was then performed to validate the conjugation efficiency and functionality of the aptamer- HRP complex. Statistical analyses were conducted using GraphPad Prism 10 software, applying ANOVA to assess significance. Results: The research demonstrated that it is possible to make a protein- aptamer hybrid molecule using conjugation. During the conjugation process, the HRP enzyme was covalently linked to the NHS- ester end of the sulfo- SMCC linker through its amino group, resulting in stable amide bond formation. The thiolated aptamer was then conjugated to the linker via thioether linkage. To evaluate the efficacy of the conjugation, a direct ELASA assay was performed using varying concentrations of the HRP-aptamer conjugate (1, 2 and 5 μM) and each concentration was tested in duplicate. The data showed that different concentrations of the conjugated aptamer significantly affected the aptamer's performance. The average optical density (OD) for the positive control samples were 0.5, 1, 1.6, corresponding to increasing concentrations of the conjugate, while negative controls consistently showed an OD of 0.04. The statistical analysis confirmed that the differences in OD between positive and negative controls were significant (P < 0.05), demonstrating successful conjugation without losing aptamer functionality. Conclusion: The findings of this investigation demonstrated that, initially, it is possible to generate a protein hybrid molecule, and that, secondly, its use is likely to be advantageous and it seems that conjugation of aptamer is possible without negatively affecting the performance of the aptamer.</div> آپتامر؛ کونژوگاسیون؛ لینکر؛ سنجش ایمنی مرتبط با آنزیم (الایزا)؛ سنجش ایمنی مبتنی بر آپتامر مرتبط با آنزیم (الازا) Aptamer, conjugation, crosslinkers, Enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA), Enzyme- linked apta- sorbent assay (ELASA) 9 20 http://pejouhesh.sbmu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1560-1&slc_lang=fa&sid=1 Mahshid Bahari مهشید بهاری 100319475328460032164 100319475328460032164 No Department of Immunology, School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran. گروه ایمونولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران. Ali Kargar Kheirabad علی کارگر خیرآباد kargarapgv@gmail.com 100319475328460032165 100319475328460032165 No Research Center for Clinical Virology, Tehran University of Medical Science, Tehran, Iran. مرکز تحقیقات ویروس‌شناسی بالینی دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران. Farshid Yeganeh فرشید یگانه fyeganeh@sbmu.ac.ir 100319475328460032166 100319475328460032166 Yes Department of Immunology, School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran. گروه ایمونولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران.